Dış Kaynaklı Proje Süreçleri Yönetim Sistemi
Özgül İ. (Yürütücü), Erson bensan A.
Uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA) en az 200 nükleotid uzunluğunda olup, protein kodlama yeteneğine sahip olmayan RNA molekülleridir. Bu tür RNA'ların, epigenetik düzenleme, gen anlatımı kontrolü, hücresel farklılaşma, gelişim ve hastalıklar gibi birçok biyolojik süreçte önemli roller üstlendiği bilinmektedir. Kanser hücrelerinde anormal düzenlenen lncRNA'lar, gen anlatımının farklı aşamalarını etkileyerek tümör oluşumuna ve metastaza katkıda bulunabilirler (Jiang vd., 2019). Örneğin meme kanseri ve/veya diğer kanserle ve epithel mekankimal dönüşümle ilişkilendirilmiş olan lncRNA’lar arasında H19, HOTAIR, LINC00518, GAS5 (growth arrest-specific transcript 5) sayılabilir (Jiang vd., 2019).
LncRNA’lar fonksiyonlarını büyük bir kısmını protein ve miRNA’lara bağlanarak gerçekleştirir. Bazı lncRNA’larda bir veya birden fazla miRNA’nın hedef bağlanma bölgeleri de bulunabilmektedir. LncRNA’lar bu şekilde belirli miRNA’ları üzerine çekip bir miRNA süngeri görevi görür ve bu sayede miRNA’ların hedef RNA’ları korunmuş olur. RBP’ler (RNA-bağlanan protein) bir lncRNA’ya bağlanarak lncRNA’nın kararlılığını, hücre içindeki konumunu ve fonksiyonunu da etkileyebilir. Örneğin, GAS5 hem miRNA hem de RBP’lerle etkileşerek pek çok farklı sinyal yolağının düzenlenmesinde görev almaktadır (Lin vd., 2022).
LncRNA’lar arasında SNHG (snoRNA Host Genes) gen ailesi de ilginç bir grup olarak karşımıza çıkmaktadır. SNHG ailesi ilk olarak snoRNA ev sahibi genler olarak tanımlanmışlardır. snoRNA'lar (küçük nükleolar RNA'lar) 65 ile 300 nükleotid arasında değişen küçük kodlamayan RNA’lar olarak önemli fonksiyonlara sahiptir. snoRNA’lar ribozomal RNA ve tRNA’lar üzerinde kimyasal modifikasyonlar yaparak, bu RNA’ların hücre içi kalıcılıklarını düzenlerler. İlginç olarak, snoRNA ev sahibi genleri, protein kodlama kapasitesine sahip olmamasına rağmen, hala dizilerinde hem intronları hem de ekzonları içermektedir. Ancak, snoRNA'lar sadece intronlardan üretilmektedir ve poli-A kuyruğu veya 5'Cap yapılara sahip değildirler. Bu sebeple de çekirdekten çıkarılmazlar. Bu durumda SNHG ailesinin snoRNA üretmek dışında da görevleri olabileceği anlaşılmaktadır. İntron özelliği taşıyan bölgelerden çıkan snoRNA’lardan farklı olarak, ekzonik özellikteki bölgeleri içeren ve hatta kırpılmaya uğrayan transkiptlerin ortaya çıkması durumunda bu RNA’lara ise lncSNHG adı verilmektedir (Xiao vd., 2023). LncSNHG’lerin ise diğer lncRNA’lar gibi miRNA süngeri olmak ve/veya RBP’ler ile etkileşmek gibi görevleri tarif edilmektedir. Örneğin SNHG1 prostat kanserinde mir-199a için sünger görevi görüp CDK7(cyclin dependent kinase 7) ve HIF-1α (hypoxia-inducible factor 1-alpha) protein seviyeleri arttırarak hücre bölünmesini ve anjiyogenezi hızlandırmaktadır (Li vd., 2017). SNHG7 kolorektal kanserde mir-216b için, SNHG15 prostat kanserinde mir-338-3p ve meme kanserinde mir-211 için, SNHG3 meme kanserinde mir-330-5p için, SNHG17 kolon kanserinde mir-375 ve mir-23a için sünger görevi görmektedir (Xiao vd., 2023). SNHG9’un ise over kanserinde mir-214-5p süngeri olarak çalışan bir tümör baskılayıcı lncRNA rolü tarif edilmiştir (Chen vd., 2021; Zhao vd., 2023).
Bu proje önerisi de snoRNA ev sahibi gen olarak tanımlanmış olan SNHG9’un meme kanseri modelinde snoRNA’lardan bağımsız etkisinin irdelenmesi üzerine kurgulanmıştır. MCF7 meme kanseri hücrelerinde yapmış olduğumuz bir RNA uzun dizilme (Nanopore, ONT) deneyinde SNHG9 lokusunda kırpılmaya uğrayan, iki ekzonlu ve kodlamayan bir RNA anlatımı olduğu ve bu RNA’nın östrojen (Estradiol, E2) ile arttığını tespit ettik (Şekil 1A,B). Ön çalışmalar kapsamında kantitatif RT-PZR ile transkriptin E2 ile arttığını doğruladık (Şekil 1C). Bu verilere dayanarak, lncSNHG9 olarak ifade edilen bu transkiptin östrojen ile ilişkili yolaklar açısından önemli olabileceğini öngörüyoruz. LncSNHG9’un diğer kanser tipleri ile de ilişkilendirilmiş olması lncSNHG9’un fonksiyonelliği açısından öngörümüzü destekler niteliktedir. Örneğin SNHG9 ifadesinin prostat kanserinde kötü sağkalım ve immün hücre infiltrasyonu ile anlamlı bir şekilde ilişkili olduğu önerilmektedir (Liv d., 2021). Meme kanseri özelinde de SNHG9’un triple negatif meme kanserlerinde, LATS1 (Large Tumor Suppressor Kinase 1)-likit damlacık oluşumunu tetikleyerek tümör baskılayıcı rolü olan Hippo yolunu inhibe edebildiği ve bu sayede onkogenik bir rolü olabileceği rapor edilmiştir (Werneburg vd., 2020). LncSNHG9’un östrojen hormonu ile birlikte artması ise östrojen ile indüklenen protein kodlayan mRNA’lar ve miRNA genleri üzerinden düzenleyici bir role sahip olabileceğini öngörüyoruz.
Ön çalışmamızda, SNH9 geni ve mikroRNA'lar arasındaki potansiyel etkileşimleri belirlemek için biyoinformatik araçlar kullanılarak mikroRNA bağlanma ihtimali yüksek olan bir dizin bölgesi olduğu da belirlenmiştir. Deneysel ve biyoinformatik verilerimizin ışığında bu hızlı destek projesi kapsamında ise E2 ile değiştiği daha önce gösterilmemiş olan SNHG9 kodlamayan RNA’sının (lncSNHG9) ER+ meme kanseri modelinde miRNA süngeri görevi olabileceği hipotezini test etmeyi amaçlıyoruz.
Deneysel ve biyoinformatik ön çalışmalarımıza dayanarak oluşturduğumuz hipotezi test etmek için iki ana hedef belirledik. İlk olarak, lncSNHG9 transkriptinin hücre içi rolünün anlaşılabilmesi için hücre içi lokalizasyonun ve hücredeki kararlılık oranının belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu sayede literatürde bazı çelişkili durumların netleştirilmesi mümkün olabilecektir. LncSNHG9 transkipti 5’cap ve poliA kuyruğu içeren bir lncRNA olarak çekirdek dışına taşınıyor olması beklenir ancak Ye vd. çalışmasında lncSNHG9’un çekirdekte bulunarak hedef gen bölgelerinde metilasyona katkı sağladığı önerilmiştir (Ye vd., 2021). LncSNHG9’un metil transferaz enzimlerini (DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B) çekerek GSTP1 promotör metilasyonunu arttırdığı önerilmiştir. Bu çalışmada sunulan bir hücre içi lokalizasyon FISH görüntüsünde LncSNHG9 tamamen çekirdekte gösterilmiştir. Bu bulgu lncSNHG9 ve miRNA etkileşimi gösterilmiş çalışmalar açısından bir çelişki yaratmaktadır. SHNG9’un sadece çekirdekte tespit edilmesinin sebebi kullanılan hücre hattına özgün bir durum olabileceği gibi, FISH için kullanılan probun lncSNHG9 intronuna denk gelmesi olabilir. Ancak biz, izoformun tek parça olarak dizilendiği ONT yöntemini kullandığımız için MCF7 hücrelerinde anlatımı olan izoformun intronu çıkmış ve iki ekzonlu bir izoform olduğunu net bir şekilde tespit etmiş durumdayız (Şekil 1A). Diğer bir çalışmada (Wang vd., 2020) ise SNHG9’un miR-21 gen bölgesinde metilasyona yol açarak miR-21 seviyesini modüle ettiği öne sürülmüş ise de bu etkinin direkt mi dolaylı mı olduğu sorusu bu çalışmada yanıtsız kalmıştır. Sonuç olarak lncRNA’ların hücreye özgü fonksiyonları olabileceği gibi, intron içermeleri de farklı çalışmaların sonuçlarının değerlendirilmesini zorlaştırmaktadır.
Ön verimiz kapsamında sunulan RNA dizileme ise poliA kuyruk içeren RNA’lar için uzun okumaya dayalı bir dizileme yapıldığından ve lncATLAS verilerine dayanarak (Şekil 2), öngörümüz MCF7 hücrelerinde lncSNHG9’un büyük oranda sitoplazmada bulunduğudur. Nitekim lncATLAS veri tabanında nükleer ve sitoplazmik olduğu bilinen lncRNA’lar pozitif kontrol olarak incelendiğinde SNHG9 ifadesinin sitoplazmada daha çok olduğu görülmektedir (Şekil 2). Sonuç olarak, ön verilerimiz ve literatür bilgisine dayanarak projede test etmek istediğimiz hipotez; östrojen ile indüklenen lncSNHG9’un miRNA süngeri olarak gen anlatımı örgüsünün düzenlenmesinde görev aldığıdır. Proje önerisinde öngörülen hipotezin doğrulanması durumunda daha detaylı araştırma sorularının sorulması mümkün olabilecektir.